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Erinnern Sie sich an das letzte Mal, als Ihre Röhrchen nach der Temperaturinkubation in einem Thermoblock oder Thermomixer Kondensationströpfchen zeigten? Schließlich hatten Sie sogar einen Leistungsverlust in Ihrer enzymatischen Reaktion.
Was ist Kondensation?
Kondensation ist definiert als der Übergang von der Gasphase in die Flüssigphase. Kondensation ist der umgekehrte Prozess der Verdampfung. Der Kondensationsprozess tritt auf, wenn der Dampf gesättigt ist und im Vergleich zu seinem Ursprung mit einer kalten (oder kälteren) Oberfläche in Kontakt kommt.
Je höher das Temperaturdelta zwischen dem wärmsten und dem kältesten Punkt innerhalb eines geschlossenen Systems ist, desto schneller tritt Kondensation auf. Der Microtube ist ein perfekt geschlossenes System.
Viele Reaktionen benötigen spezifische Temperaturen über Raumtemperatur wie 37°C, 42°C, 95°C usw. Infolgedessen führt ein Inkubationsschritt von 30 min bei z. B. 65 ° C zu einer Schicht von Kondensattröpfchen im Deckel Ihres Röhrchens. Sie denken vielleicht, ein Spin in der Zentrifuge und 100% der Probe befinden sich wieder am Boden des Mikroröhrchens. Dieser Prozess hilft in der Tat, die Kondensationströpfchen zu Ihrer Probe zurückzubringen.
Es kann jedoch immer noch ein Problem mit der durchgeführten Reaktion geben, die ausgeführt wird, wenn Sie Ihren Zentrifugationsschritt starten. Reagenzien benötigen konstante Bedingungen für molekulare Prozesse wie Ligation, Amplifikation, Translation, Restriktion oder welche enzymatische Reaktion auch immer durchgeführt werden muss.
Die Reaktivität eines Enzyms hängt von der Temperatur, der Verfügbarkeit von Reaktionspartnern aber auch von der Salzkonzentration in der Probe ab. Unter der Annahme eines 25 µL enzymatischen Assays, der eine Salzkonzentration von z.B. 5 % aufweist. Da der Kondensationsprozess auf Flüssigkeiten beschränkt ist, erhöht das berechnete 3 µL Kondensat im Deckel die Salzkonzentration in der verbleibenden Probe am Boden des Röhrchens während des enzymatischen Reaktionsschritts um fast 14 %.
(Faustregel: 5 % von 25 µL Reaktionsvolumen: 1,25 µg Salz, 22 µL Flüssigkeit inkl. das Salz bleibt nach der Kondensation, dies ist jetzt 5,682% des Gesamtvolumens; was zu einer 13,6% höheren Salzkonzentration führt)
Diese erhöhte Salzkonzentration wird wahrscheinlich Ihre Reaktion nicht stoppen, könnte aber die Effizienz des Enzyms beeinflussen, was zu einer anderen Ausbeute führt als unter optimierten Bedingungen möglich. Unterm Strich fehlen Ihnen konstante / reproduzierbare und effiziente Bedingungen.
Es gibt eine einfache und bequeme Möglichkeit, Kondensation zu vermeiden: Halten Sie Ihre Probenflüssigkeiten an der „kältesten Stelle“ im Reaktionsrohr. Sicher wird die Reaktionstemperatur auf z.B. 70°C eingestellt. Wie geht man vor?
Eine Lösung kann eine Gegenheizung von der Oberseite des Gefäßes durch einen beheizten Deckel sein.